Regel 1: In elk topic van de Klaagbaak Slowchat (vanaf nu 'KLB SC'), het liefst op elke pagina, moet(en) er altijd één of meer vrouwelijke user(s) zijn die haar heerlijke malse tetjes of gelaat vol mannenpap post.
Regel 2: Vanillekwark mag altijd wijzigingen aan deze OP aanbrengen.
Regel 3: De OP volspammen met aantrekkelijke dames of 'lekkere wijven' is een teken van oppervlakkigheid en vanaf nu ten strengste verboden. Alle uitingen van Chloe Bennet (Skye/Daisy Johnson), Emma Watson (Hermione Granger), SFW pornosterren of andere dames mogen verzameld worden in één spoiler tussen de OP en de code-spoiler.
REGELS ZIJN REGELS EN DEZE MOETEN WORDEN NAGELEEFD
SPOILER
SPOILEROP verneukt? Hier de code.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15[img=640,71]http://i.imgur.com/CPFZq.jpg[/img]
[img=640,60]https://dl.dropbox.com/u/202677/Fok/Topicaids/klbsc/users.png[/img]
[img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/328924/Oranje_yey.gif[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/252326/ui.gif[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/323370/UI.jpg[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/370448/faberyayo-.png[/img] [img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/440248/AVA001.gif[/img] [img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/367594/FDReb.jpg[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/359953/roxbury.gif[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/380389/usericoon.gif[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/396730/image-2014-11-02.jpg[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/406136/Wenger.jpg[/img]
[img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/324470/cloudsheeps.jpg[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/88815/fernando.jpg[/img] [img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/434617/1weird.jpg[/img] [img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/402488/isaacmark.gif[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/329463/constan3.png[/img] [img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/344319/arya-gif.gif[/img] [img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/412650/TD2016-1.gif[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/319274/avatar.png[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/64831/4QWKU.gif[/img] [img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/395200/deadprez.png[/img]
[img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/392219/gg7ui.jpg[/img] [img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/452506/XOXO_gold.png[/img] [img=60]http://i.fokzine.net/usericons/410727/rose.jpg[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/181129/96hy7a.jpg[/img] [img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/438758/Untitled2.gif[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/385265/fgg.gif[/img] [img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/394638/img173110159.jpeg[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/440936/pow_061008.jpg[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/419909/sneeuwgroothzaw.gif[/img] [img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/391629/hoink02.gif[/img]
[img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/346137/bertlerui.png[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/404048/cah.png[/img] [img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/255992/Hammer.png[/img] [img=60,60]http://i.fokzine.net/usericons/429888/manaap.png[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/179899/ggaaf.jpg[/img] [img=60,60]http://i.fok.nl/usericons/452505/Untitled.png[/img]
[img=640,60]https://dl.dropbox.com/u/202677/Fok/Topicaids/klbsc/regels.png[/img]
[b]Regel 1: In elk topic van de Klaagbaak Slowchat (vanaf nu 'KLB SC'), het liefst op elke pagina, moet(en) er altijd één of meer vrouwelijke user(s) zijn die haar heerlijke malse tetjes of gelaat vol mannenpap post.
Regel 2: Vanillekwark mag nooit wijzigingen aan deze OP aanbrengen.
Regel 3: De OP volspammen met aantrekkelijke dames of 'lekkere wijven' is een teken van oppervlakkigheid en vanaf nu ten strengste verboden. Alle uitingen van Chloe Bennet (Skye/Daisy Johnson), Emma Watson (Hermione Granger), SFW pornosterren of andere dames mogen verzameld worden in één spoiler tussen de OP en de code-spoiler. [/b]
[i][u][b]REGELS ZIJN REGELS EN DEZE MOETEN WORDEN NAGELEEFD[/b][/u][/i]
quote:
quote:Ik ben vanavond wel even in Utrecht geweest (Wat een klote stad om in te rijden zeg.. Die rare rotondes daar bij de Missisippidreef en dergelijk slaan kant noch wal.)
Ik ben strijdbaar.quote:Op dinsdag 26 januari 2016 15:24 schreef 2NutZ het volgende:
[..]
Nee, man laat die gare ventjes gewoon in hun sop gaar koken.
Je moet die strijd ergens strijden idd. Sommige doen dat op FOK!.quote:
quote:
Doet 2Nutz ook altijd. Zou dit advies dus vooral van hem opvolgen.quote:
Nee, man laat die gare ventjes gewoon in hun sop gaar koken.
quote:
Mijn advies sowieso volgen idd. Meest slimme.quote:
[..]
[..]
Doet 2Nutz ook altijd. Zou dit advies dus vooral van hem opvolgen.
[..]
Kun je jaren door op Fok!quote:
Mijn advies sowieso volgen idd. Meest slimme.
Precies en dat willen we hier allemaal.quote:
Popcorn erbij voor de rest. Lekker toch. Eeuwige kusje kroel in een SC is ook zo saai.quote:
[..]
Je moet die strijd ergens strijden idd. Sommige doen dat op FOK!.
Zeker, gelukkig zijn er nog gebruikers zoals jij.quote:
[..]
Popcorn erbij voor de rest. Lekker toch. Eeuwige kusje kroel in een SC is ook zo saai.
Eerst maar eens een echte kusje kroel scoren vriend.quote:
Eeuwige kusje kroel in een SC is ook zo saai.
Valt wel mee toch?quote:
Noot heeft medestanders nodig.quote:
oke die was wel aardig smartassquote:Op dinsdag 26 januari 2016 15:29 schreef hoink581 het volgende:
[..]
Eerst maar eens een echte kusje kroel scoren vriend.
Is van de Bradster op Autoweek. Oppassen dus.quote:
quote:
Dat ben ik in een notendop idd... steeds vrienden, billenmaten en medestanders zoekenquote:
okquote:
Machiavellist ten top.quote:
Dat ben ik in een notendop idd... steeds vrienden, billenmaten en medestanders zoeken
Haat zn leven nu
SPOILER
ja machiavelli zocht idd naar vriendenquote:
quote:
[..]
Is van de Bradster op Autoweek. Oppassen dus.
Zal wel 9 december zijn geweest;
http://www.asmedia.nl/nie(...)pidreef-utrecht.html
blubberreet, tattoo, 4/10quote:
Met zulke plaatjes ben je veel minder zielig iddquote:
kom danquote:
daarmee kwets je vrouwen hequote:
[..]
blubberreet, tattoo, 4/10
Nee een vriend van hem reed.quote:
[..]
Zal wel 9 december zijn geweest;
http://www.asmedia.nl/nie(...)pidreef-utrecht.html
Makaveli in this. Killuminatiquote:
Oké.quote:
quote:
ja machiavelli zocht idd naar vrienden
en dan blame en flame op andere als ze nie inhoudelijk op je ingaan hampelquote:
nee dat was hermanquote:
zette die tjap z'n eigen dood niet in scene om daarna tantoehard terug te slaan omdat ze dat niet verwachtten?
Mensen tegen elkaar uitspelen gaat iets makkelijker als je medestanders hebt, makker.quote:
en dan blame en flame op andere als ze nie inhoudelijk op je ingaan hampel
ok manquote:
All through your bodyquote:
[..]
Makaveli in this. Killuminati
Lika a 12 gauge shotty
Dat is tardis die dat doet.quote:
[..]
en dan blame en flame op andere als ze nie inhoudelijk op je ingaan hampel
quote:
[..]
Makaveli in this. Killuminati
Hail Myrr.quote:Op dinsdag 26 januari 2016 15:39 schreef Che_ het volgende:
[..]
All through your body
Lika a 12 gauge shotty
sws een van z'n beste nummersquote:
[..]
All through your body
Lika a 12 gauge shotty
Neee weer die zwangerschaps bullshit..quote:
Challas
quote:
[..]
Neee weer die zwangerschaps bullshit..
Challas
baby is er al uit
Neee weer deze inb4..quote:
[..]
Neee weer die zwangerschaps bullshit..
Challas
In mijn tijd nog paar turken bang gemaakt door dat op de voicemail achter te laten bij zequote:
haha bange turken lol
Heb veel last van zachte buiken.quote:
[..]
Neee weer die zwangerschaps bullshit..
Challas
babyverhalen incommingquote:
picture me rollinquote:
[..]
sws een van z'n beste nummers
De huil-o-foon gaat af.
Dit verhaal zou ik graag horen.quote:
In mijn tijd nog paar turken bang gemaakt door dat op de voicemail achter te laten bij ze
haha bange turken lol
quote:
.Weet jij goede dieprood gekleurde lipstickie
anti-climax dit hoorquote:
Nee moet weer weg.
De huil-o-foon gaat af.
Maar nu klaar weer heh. Nog leuke dingen gedaan iemand?
Ja, snap ik met de jeugd die jij hebt door moeten maken.quote:
Kinderbloed gemengd met rode wijn.quote:
CRIP
Weet jij goede dieprood gekleurde lipstickie
Je weet niks a sahbequote:
Op Zo'n kleur?quote:
CRIP
Weet jij goede dieprood gekleurde lipstickie
SPOILER
en dat baseer je op watquote:
[..]
Mensen tegen elkaar uitspelen gaat iets makkelijker als je medestanders hebt, makker.
Weer stuk om deze fotoquote:
Weet niet wrm
Matig dit. Maar dat past in je straatje.quote:
Ja, snap ik met de jeugd die jij hebt door moeten maken.
dt kanquote:
Ga ik weer eens opzetten in de waggie als ik naar huis ga.quote:
Danke
Als 13-jarig blank mannetje vanaf je zolder Tupac muk posten. Als dát je geen street cred oplevert, wat dan wel?quote:
Gewoon Mac. Of van de Hema (long lasting matt 06) mengen met een donkere lappotlood. Zit eeuwig goed, wel droge lippen einde van de dag maar dat heb je met Mac ook.quote:
CRIP
Weet jij goede dieprood gekleurde lipstickie
[ Bericht 6% gewijzigd door #ANONIEM op 26-01-2016 15:50:06 ]
Ja.quote:
[..]
Matig dit. Maar dat past in je straatje.
Oh nee dat is mij te donker, roodheid moet nog wel te zien zijn zegmaquote:
Nice pics
Ik meng een chanel lipstick al met eyeliner om het donker te krijgenquote:
[..]
Gewoon Mac. Of van de Hema (long lasting matt 06) mengen met een donkere lappotlood. Zit eeuwig goed, wel droge lippen einde van de dag maar dat heb je met Mac ook.
wil gwn eentje wat uit zichzelf al donker isDiva van MACquote:
[..]
Oh nee dat is mij te donker, roodheid moet nog wel te zien zijn zegma
Nice pics
Zo waar dit! Alleen negers mogen muziek van een neger posten en alleen blanken mogen muziek van blanken posten.quote:Op dinsdag 26 januari 2016 15:49 schreef Modus het volgende:
[..]
Als 13-jarig blank mannetje vanaf je zolder Tupac muk posten. Als dát je geen street cred oplevert, wat dan wel?
Klinkt lekker, zullen we dat eens drinken?quote:
[..]
Kinderbloed gemengd met rode wijn.
😂😂quote:
En alleen als ze affiliëren met de inhoud van de teksten.quote:
[..]
Zo waar dit! Alleen negers mogen muziek van een neger posten en alleen blanken mogen muziek van blanken posten.
OMG JA ZOIETSquote:
Morgen ff naar kijken
hou je kusjes bij je ewquote:
Toon ik oprechte interesse, ga je meteen weer miepen. Verongelijkte zure kneus ben je.quote:
jij mag dan alleen jostiband muziek posten hahahah snap jequote:
[..]
Zo waar dit! Alleen negers mogen muziek van een neger posten en alleen blanken mogen muziek van blanken posten.
Zet maar een datumpje, neem ik TARDIS voor je mee.quote:
Klinkt lekker, zullen we dat eens drinken?
Nee, kan je het uitleggen?quote:
[..]
jij mag dan alleen jostiband muziek posten hahahah snap je
En dan gaan ze seks hebben maar dan begint hij te huilen om zijn ex, zou niet doen Opso.quote:
[..]
Zet maar een datumpje, neem ik TARDIS voor je mee.
begin je weerquote:
Wowquote:
Ga je me die mcnulty treatment geven
Zoals je ziet.quote:
Ik vind jou best wel een achterbaks flikkertje trouwens. Elke keer maar dat haten om te haten.quote:
En dan gaan ze seks hebben maar dan begint hij te huilen om zijn ex, zou niet doen Opso.
ik snap hem zelf ook niet zo goedquote:
Maak je ff op in 5 mins en ga dan serie kijkenquote:
Gawd ik heb zin om me op te maken nu. Maar wil ook een serie kijken. Keuzes, keuzes.
Oplichters
Street cred op een forum zoeken? Ik dacht dat je hier alleen seks kon regelen voor mensen zoals jij die niks in het buitenleven kon regelen. Nog hulp nodig?quote:
[..]
Als 13-jarig blank mannetje vanaf je zolder Tupac muk posten. Als dát je geen street cred oplevert, wat dan wel?
Hij zou op mijn schouder mogen uithuilen terwijl hoink zakdoekjes haaltquote:
[..]
En dan gaan ze seks hebben maar dan begint hij te huilen om zijn ex, zou niet doen Opso.
Sok in de broek toch.quote:
Jullie houden mannen bewust voor de gek door jullie mooier voor te doen dan dat jullie daadwerkelijk zijn.
Oplichters
zou bij jou ook geen kwaad kunnen denk ikquote:
Jullie houden mannen bewust voor de gek door jullie mooier voor te doen dan dat jullie daadwerkelijk zijn.
Oplichters
Ja maar ik heb zin om uitbundig te doen, met ombre lippen en smokey eyes enzo.quote:
[..]
Maak je ff op in 5 mins en ga dan serie kijken
Beter in je schoot. En ik heb liever katoenen zakdoeken.quote:
Hij zou op mijn schouder mogen uithuilen terwijl hoink zakdoekjes haalt
'ja' is miepen? oké. mad i guess.quote:Op dinsdag 26 januari 2016 15:52 schreef hoink581 het volgende:
[..]
Toon ik oprechte interesse, ga je meteen weer miepen. Verongelijkte zure kneus ben je.
first world problemquote:
Gawd ik heb zin om me op te maken nu. Maar wil ook een serie kijken. Keuzes, keuzes.
Nou sorry dat ik mijzelf opmaken leuk vind. Denk je nou echt dat ik mooi probeer te doen voor mannen.quote:
Jullie houden mannen bewust voor de gek door jullie mooier voor te doen dan dat jullie daadwerkelijk zijn.
Oplichters
HAHAHAH
gekkie ik was toch bij je gisteravondquote:
[..]
Wow
Ga je me die mcnulty treatment geven
Luxeproblemenquote:
ga huilequote:
Jullie houden mannen bewust voor de gek door jullie mooier voor te doen dan dat jullie daadwerkelijk zijn.
Oplichters
Ik zou voor opmaken gaanquote:
[..]
Ja maar ik heb zin om uitbundig te doen, met ombre lippen en smokey eyes enzo.
In mn schoot nog welquote:
[..]
Beter in je schoot. En ik heb liever katoenen zakdoeken.
Echt achterbaks ja iets hier posten wat iedereen kan lezen.quote:Op dinsdag 26 januari 2016 15:55 schreef hoink581 het volgende:
[..]
Ik vind jou best wel een achterbaks flikkertje trouwens. Elke keer maar dat haten om te haten.
Zat vrouwen die ook gewoon met een dinsdagdip kop door de supermarkt lopen.quote:
Jullie houden mannen bewust voor de gek door jullie mooier voor te doen dan dat jullie daadwerkelijk zijn.
Oplichters
Ik ga toch geen make up op doen johquote:
[..]
zou bij jou ook geen kwaad kunnen denk ik
waarom niet allebei? Ik maak me op echt 2 uur lang ofzo terwijl ik serie kijkquote:
[..]
Ja maar ik heb zin om uitbundig te doen, met ombre lippen en smokey eyes enzo.
Ik ga dit niet ontkrachten. Als je domme types iets voor de zoveelste keer moet uitleggen voel je je zelf ook gelijk een debiel.quote:
Ja hoor 2Nutz, mad, jelly diep etc.
wrm niet?quote:
[..]
Ik ga toch geen make up op doen joh
We komen er samen vast wel uit.quote:
[..]
ik snap hem zelf ook niet zo goed
Hij is er niet toch of wel?quote:
Echt achterbaks ja iets hier posten wat iedereen kan lezen.
Probs voor die vrouwen ja.quote:
[..]
Zat vrouwen die ook gewoon met een dinsdagdip kop door de supermarkt lopen.
Volgende dag opeens strakkere kleding. ben echt een erg mens
ies niet nodigquote:
Vruchtbare tranen plengt die jongen. Godsgeschenk.quote:
Keiharde comeback hoor. Zit emotioneel even helemaal stuk nu.quote:
[..]
Street cred op een forum zoeken? Ik dacht dat je hier alleen seks kon regelen voor mensen zoals jij die niks in het buitenleven kon regelen. Nog hulp nodig?
Slippers boxers baardquote:
[..]
Zat vrouwen die ook gewoon met een dinsdagdip kop door de supermarkt lopen.
In de zomer
Ja.quote:
[..]
Nou sorry dat ik mijzelf opmaken leuk vind. Denk je nou echt dat ik mooi probeer te doen voor mannen.
ben jij er zo een ja?quote:
Ik maak me altijd mooi op zodat ik bij jou kan opvallen maar je ziet me nooit staanquote:
Zijn dezelfde vrouwen die er op andere momenten vol opgemaakt bij lopen...quote:
Elke vrouw doet dan om die redenquote:
En maar beweren dat het mooi is
Beste is natural toch
Is goed. Kut ja.quote:
[..]
Ik ga dit niet ontkrachten. Als je domme types iets voor de zoveelste keer moet uitleggen voel je je zelf ook gelijk een debiel.
Ja hoor 2Nutz, mad, jelly diep etc.
Alsof hij het niet leest.quote:
Gisteren was er ook een post van iemand in een gesloten topic en toen kwam hij daar nog mee aan zetten in het open topic.Maar jij hebt vast ook nooit iets gezegd over een user die er op dat moment niet was, want zo'n hypocriet ben je vast niet.
Het is beide prima. Gewoon afwisselen.quote:
[..]
Elke vrouw doet dan om die reden
En maar beweren dat het mooi is
Beste is natural toch
Met zo een bedoel je dorpsgek?quote:
Nee, ga gewoon casual. 3-delige pak, krokodilleer schoenen. Gewoon zondagsoutfitje
Ik wil pas kinderen op mn 27e srryquote:
[..]
Vruchtbare tranen plengt die jongen. Godsgeschenk.
Niet.quote:
[..]
Zijn dezelfde vrouwen die er op andere momenten vol opgemaakt bij lopen...
Als er geen (aantrekkelijke) mannen waren kan je er donder op zeggen dat ze redelijk snel afhaken met make up.quote:
[..]
Elke vrouw doet dan om die reden
En maar beweren dat het mooi is
Beste is natural toch
Hij leest het sowieso idd.quote:
[..]
Alsof hij het niet leest.
Maar jij hebt vast ook nooit iets gezegd over een user die er op dat moment niet was, want zo'n hypocriet ben je vast niet.
Voor jou zo ik mij helemaal zwart makenquote:
Hoe meer make up, hoe lelijkerquote:
[..]
Het is beide prima. Gewoon afwisselen.
Niet weten dat vrouwen zich mooi opmaken om andere bitches te kop in te drukken.quote:
[..]
Als er geen (aantrekkelijke) mannen waren kan je er donder op zeggen dat ze redelijk snel afhaken met make up.
ja maar vrouwen geven niet om je mening, wrm begrijp je dat nietquote:
[..]
Hoe meer make up, hoe lelijker
YESquote:Op dinsdag 26 januari 2016 16:00 schreef Modus het volgende:
[..]
Keiharde comeback hoor. Zit emotioneel even helemaal stuk nu.
Is mijn street cred nu omhoog?Ja.. en waarom? juist, kapers op de kust.quote:
[..]
Niet weten dat vrouwen zich mooi opmaken om andere bitches te kop in te drukken.
quote:
[..]
Niet weten dat vrouwen zich mooi opmaken om andere bitches te kop in te drukken.
Dit wel ja. En dan zo pfff je contour is echt kaolo lelijk terwijl in in reality zegt heey gurl alles flexquote:
[..]
Niet weten dat vrouwen zich mooi opmaken om andere bitches te kop in te drukken.
en ik niet om die van jouquote:
[..]
ja maar vrouwen geven niet om je mening, wrm begrijp je dat niet
Waarschijnlijk krulde hoink zijn snor nog harder dan normaal en kopieerde hij woest die post naar zijn holmaatje. Zo gaat dat in die kringen, als iemand op FOK! iets over je ex zegt dan stuur je haar gewoon even een bericht op FB ook.quote:
goeie comebackquote:
Ik denk niet eens aan een comebackquote:
Als ik al mn tentamens haal koop ik ze allemaal.
Iets met belonen en zo ja tochhh
Ik denk aan jouquote:
[..]
Ik denk niet eens aan een comeback
Gewoon hem aldoor al zijn getracht-intellectuele-hersenscheten laten plempen, is hij weer blij.. verder gewoon negeren en om lachen. Want je moet er wel om kunnen lachen zo 1 toch...quote:
[..]
Waarschijnlijk krulde hoink zijn snor nog harder dan normaal en kopieerde hij woest die post naar zijn holmaatje. Zo gaat dat in die kringen, als iemand iets over je ex zegt dan stuur je haar gewoon even een bericht op FB ook.
toch?
Leg high pressure liquid chromatografie eens uit voor niveauverhogingquote:
High-performance liquid chromatographyquote:
[..]
Leg high pressure liquid chromatografie eens uit voor niveauverhoging
Kolom in een HPLC-opstelling
High-performance liquid chromatography (HPLC) is een scheidingsmethode; het is vloeistofchromatografie waarbij de eluens onder hoge druk door een sterk gepakte kolom wordt gepompt.
De druk kan voor normale HPLC oplopen tot zo'n 200 bar. Voor UHPLC (Ultra High performance Liquid Chromatography) kan de druk zelfs zo'n 1000 bar of meer zijn. Door de hoge druk en het goede contact met de stationaire fase wordt een relatief grote snelheid bereikt van de scheiding, en een zeer goede resolutie. Een typische looptijd voor de meting van één monster met HPLC ligt tussen de 5 en 60 minuten.
Inhoud [verbergen]
1 Principe
2 Scheidingsmethoden
2.1 Normal Phase chromatografie
2.1.1 Hydrophilic-Interaction Liquid Chromatography (HILIC)
2.2 Reversed Phase chromatografie
2.2.1 Paired-Ion Chromatography
2.2.2 Hydrophobic-Interaction Chromatography (HIC)
2.3 Ion-Exchange Chromatography (IEC)
2.4 Chirale chromatografie
3 Detectiemethoden
4 Kolomeigenschappen
5 Kwantificering
6 Autosampler
7 Referenties
Principe[bewerken]
Het monster wordt geïnjecteerd met een injector. Deze injector is een soort kraan met een loop eraan, een lus met een nauwkeurig bekend volume (gewoonlijk 5μl-5mL). Met een injectiespuit vult men deze loop, waarna de stand van de kraan wordt gedraaid, zodat het monster in het systeem wordt geïnjecteerd. Hierna gaat het monster mee met de mobiele fase door de kolom. Door de relatief hoge snelheid van de mobiele fase vindt er nauwelijks diffusie plaats van het monster in het oplosmiddel.
De snelheid waarmee de componenten van het monster de kolom passeren kan beïnvloed worden door een modifier die de elutie versnelt, toe te voegen aan de mobiele fase. Het percentage modifier kan gedurende de hele analyse gelijk blijven (isocratische chromatografie) of gedurende de analyse oplopen (gradiënt).
De toegepaste modifier is afhankelijk van het type chromatografie.
Type chromatografie Veelgebruikte basiseluensen Veelgebruikte modifiers
Reversed phase chromatografie Water, eventueel met bufferzouten en/of andere hulpstoffen Methanol, acetonitril
Normal phase chromatografie Hexaan (of vergelijkbare alkanen), methanol, acetonitril Water, methanol, acetonitril
Ion-Exchange chromatografie Oplossingen van natriumhydroxide, natriumcarbonaat en andere zouten Oplossingen van natriumacetaat, natriumwaterstofcarbonaat en andere zouten
Andere factoren die van belang zijn bij de scheiding zijn: samenstelling van het eluens (pH, toevoeging van hulpstoffen), kolomtype, doorstroomsnelheid (flow), lengte van de leidingen.
Scheidingsmethoden[bewerken]
De binnenkant van de kolom, de stationaire fase, is gevuld met een pakking van kleine bolletjes. Deze pakking is meestal van silica, maar andere materialen komen ook voor. De grootte van de bolletjes is afhankelijk van het type kolom, maar diameters tussen 3 μm en 5 μm zijn het meest gebruikelijk. Kleinere deeltjes geven een betere scheiding dan grotere deeltjes, maar ook een hogere druk. De consequentie daarvan is dat er bij een kolom met grote deeltjes meer ruimte is om de flow te variëren. De bolletjes zijn 'bekleed' (chemisch gebonden) met een actieve laag die een interactie aangaat met de mobiele fase en de componenten van het te analyseren monster.
Normal Phase chromatografie[bewerken]
Bij Normal Phase HPLC is de pakking van de kolom polair en de mobiele fase apolair. Daardoor hebben polaire componenten een sterkere interactie met de stationaire fase dan apolaire componenten. Apolaire componenten komen dus sneller van de kolom af dan polaire componenten. Vanwege het hoge verbruik van organische oplosmiddelen wordt Normal Phase HPLC nog maar weinig toegepast, voor de meeste toepassingen bestaat een milieuvriendelijker Reversed Phase alternatief.
Hydrophilic-Interaction Liquid Chromatography (HILIC)[bewerken]
HILIC is een variant op Normal Phase HPLC. Bij NPLC wordt als mobiele fase een apolair oplosmiddel gebruikt. Dit brengt het probleem met zich mee dat sommige stoffen zo hydrofiel zijn dat ze niet meer van de kolom afkomen. Door minder dan 20% water toe te voegen aan het eluens kan er echter voor gezorgd worden dat ook deze stoffen van de kolom afkomen. Door de competitie van het water en de stoffen voor binding aan de kolom, worden alle stoffen uiteindelijk van de kolom verdreven door het water en komen dus in volgorde van toenemende polariteit van de kolom af. Het toevoegen van water kan zowel isocratisch als met een gradiënt gebeuren.
Reversed Phase chromatografie[bewerken]
Bij Reversed Phase HPLC is de polariteit omgekeerd ten opzichte van Normal Phase HPLC; de pakking van de kolom is apolair en de mobiele fase is polair. Het gevolg daarvan is dat de volgorde van elutie van de verschillende componenten ook omgekeerd is ten opzichte van Normal Phase HPLC: polaire componenten komen sneller van de kolom af dan apolaire componenten.
Paired-Ion Chromatography[bewerken]
Deze techniek wordt gebruikt om met een Reversed Phase kolom, sterk polaire stoffen te scheiden. Normaal zouden de stoffen helemaal niet binden aan de stationaire fase van de kolom, omdat die apolair is. Hierdoor vindt er ook geen scheiding plaats, ze komen namelijk allemaal even snel van de kolom af. Wanneer aanpassing van de pH van de mobiele fase niet voldoende is om de polariteit van de stoffen te laten afnemen, kan er een Ion Pairing Reagent worden toegevoegd aan de mobiele fase.
Een Ion Pairing reagent is een stof die bestaat uit een koolstofketen en een functionele groep waarvan de lading tegenovergesteld is aan de analyte die gescheiden moet worden. De analiet en de ion pairing reagent vormen een "geneutraliseerd" ionenpaar, dat minder polair is en redelijk stabiel. Doordat dit ionenpaar minder polair is blijft het aan de stationaire fase zitten en hierdoor kan het gescheiden worden.
Hydrophobic-Interaction Chromatography (HIC)[bewerken]
Deze methode is een variant van Reversed Phase HPLC een wordt veelal toegepast bij de scheiding van eiwitten. Voor een goede detectie van de verschillende eiwitten is het noodzakelijk dat deze in een waterige oplossing blijven en niet in aanraking komen met oplosmiddelen of oppervlakken die hen kunnen denatureren. Door een zoutgradiënt aan te leggen met hoge zoutgehalten in het begin, wordt het evenwicht van de eiwitten tussen mobiele fase en stationaire fase richting de stationaire fase gedreven. Door het zoutgehalte vervolgens langzaam te verlagen, komen de eiwitten weer van de kolom af.
Ion-Exchange Chromatography (IEC)[bewerken]
In het voorafgaande hebben we gezien dat scheiding met behulp van een HPLC meestal plaatsvindt op basis van polariteit, waarbij polaire stoffen een grote affiniteit voor elkaar hebben, maar niet voor apolaire stoffen. Bij ionchromatografie op basis van elektrische lading is dit precies andersom. Positieve lading stoot immers positieve lading af en trekt juist negatieve lading aan. De stationaire fasen in IEC worden gekarakteriseerd door de sterkte van de zure of basische groepen en het soort ionen dat ze binden.
Kationuitwisseling wordt gebruikt om positief geladen ionen (kationen) te binden aan een negatief oppervlak en anionuitwisseling om negatief geladen ionen (anionen) te binden aan een positief oppervlak. Om zwakke zuren of basen van elkaar te scheiden wordt gebruikgemaakt van sterke ion exchangers, die hun lading behouden binnen een groot pH bereik. De zwakke zuren of basen worden dus in geïoniseerde vorm op de kolom gebracht, waardoor ze aan de stationaire fase kunnen binden. Vervolgens wordt de pH van de mobiele fase zo aangepast dat stof neutraal wordt. De stationaire fase blijft echter geladen, omdat deze sterke zure of basische groepen heeft. Hierdoor verdwijnt de affiniteit tussen de stof en de stationaire fase en komt deze stof van de kolom af.
Bij de scheiding van sterke zuren of basen wordt het principe precies omgekeerd en wordt er gebruikgemaakt van een stationaire fase met zwakke zure of basische groepen. Hierdoor wordt de stationaire fase neutraal, wanneer de pH wordt veranderd en verdwijnt wederom de affiniteit tussen de stof en de stationaire fase, waardoor deze van de kolom afkomt.
Chirale chromatografie[bewerken]
Wanneer de structuurformule van de te analyseren stof een asymmetrisch koolstofatoom bevat betekent dit meestal dat de stof aanwezig is in een mengsel van R en S enantiomeren. Dit mengsel is met een normale kolom niet te onderscheiden, omdat ze in gelijke mate binden aan de stationaire fase. De twee stoffen komen dan gelijkertijd van de kolom en geven maar één piek bij de detector. Dit kan wel met een chirale kolom waarin ook de stationaire fase uit enantiomeren bestaat. De scheiding wordt veroorzaakt door de reversibele bindingen van R (analiet) / R (stationaire fase en S (analiet) / S (stationaire fase) waarvan de stabiliteit iets verschilt. Het verschil in stabiliteit van de binding leidt ertoe dat er een scheiding plaatsvindt en dat er uiteindelijk twee pieken ontstaan.
Detectiemethoden[bewerken]
1rightarrow blue.svg Zie Detector (chromatografie) voor het hoofdartikel over dit onderwerp.
De chromatografie is belangrijk om de compositie van het monster te bepalen, maar om de concentratie van het monster te bepalen is er een bepaalde detector nodig. Er zijn verschillenden detectoren voor HPLC. Enkele veelgebruikte zijn de volgende:
Spectrofotometrie: Meet de absorptie van licht bij een specifieke golflengte
Fluorescentiedetector: meet fluorescentie (emissie van licht door aangeslagen moleculen)
Brekingsindexdetector
Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)
Massaspectrometrie
Kolomeigenschappen[bewerken]
Eigenschap Invloed op de scheiding
Kolomdiameter Kolommen met een kleine diameter geven smallere en hogere pieken dan kolommen met een grote diameter. Daardoor is de detectielimiet lager. Kolommen met een kleine diameter zijn geschikt voor monsters waarin de concentratie van de te analyseren stof laag is. Als de concentratie van de te analyseren stof hoog is kan beter een kolom met een grote diameter gebruikt worden omdat anders overbelading van de kolom op kan treden.
Kolomlengte Een lange kolom geeft een betere scheiding dan een korte kolom. Daarom zijn lange kolommen geschikt voor monsters die veel verschillende componenten bevatten of wanneer er twee componenten met een klein polariteitsverschil gescheiden moeten worden.
Deeltjesgrootte Een kolom met kleine deeltjes geeft een betere scheiding, maar ook een hogere druk en is dus niet geschikt voor hoge flows. Kolommen met grote deeltjes zijn vooral geschikt wanneer snelheid belangrijker is dan een goede scheiding en voor preparatieve chromatografie.
Pakkingsmateriaal Een C18 kolom is minder polair dan een C8 kolom en heeft dus meer interactie met apolaire moleculen. C8 en C4 kolommen zijn geschikt voor polaire monsters zoals bijvoorbeeld peptiden.
Kwantificering[bewerken]
Hoe hoger de concentratie van de geïnjecteerde verbinding hoe groter het signaal dat door de detector wordt afgegeven. Het signaal heeft de vorm van een piek (in een grafiek) en men gebruikt het gemeten piekoppervlak om concentraties mee te kwantificeren. Door verschillende concentraties van een standaard te injecteren kan een ijklijn geconstrueerd worden. In een ijklijn worden dus de piekoppervlakten uitgezet tegen de bekende bijbehorende concentraties. Als van dezelfde verbinding met een onbekende concentratie het piekoppervlak wordt bepaald, wordt die waarde geïnterpoleerd in de ijklijn en wordt aldus de concentratie bepaald. De gevonden concentraties moeten nog omgerekend worden naar volume- of gewichtseenheden.
Autosampler[bewerken]
Een autosampler is een robot die de monsters injecteert op de HPLC-kolom. Injecties door een autosampler zijn nauwkeuriger en reproduceerbaarder dan handmatige injecties en daarnaast is het met een autosampler mogelijk om meerdere monsters achter elkaar te meten zonder dat menselijke interventie noodzakelijk is. Een autosampler kan geprogrammeerd worden met behulp van de elektronica van de HPLC zelf of met behulp van een chromatografiedatasysteem.
Referenties[bewerken]
Rouessac, F. and A., Chemical Analysis, Second Edition, John Wiley and Sons, Ltd – University of Le Mans, France 2007, first printing, pag. 80-86, ISBN 978-0-470-85902-5
Scott R.P.W., 2008, fluorescence detector, geraadpleegd op 17-06-2010
Categorie: Chromatografie
Navigatiemenu
Niet aangemeldOverlegBijdragenRegistrerenAanmeldenArtikelOverlegLezenBewerkenGeschiedenis
Zoeken
Artikel
Hoofdpagina
Vind een artikel
Vandaag
Etalage
Categorieën
Recente wijzigingen
Nieuwe artikelen
Willekeurige pagina
Informatie
Gebruikersportaal
Snelcursus
Hulp en contact
Donaties
Hulpmiddelen
Links naar deze pagina
Verwante wijzigingen
Bestand uploaden
Speciale pagina's
Permanente koppeling
Paginagegevens
Wikidata-item
Deze pagina citeren
Afdrukken/exporteren
Boek maken
Downloaden als PDF
Printervriendelijke versie
In andere talen
العربية
Български
Bosanski
Català
Če¨tina
Deutsch
English
Español
Eesti
فارسی
Suomi
Français
עברית
Hrvatski
Magyar
Bahasa Indonesia
Italiano
日本語
ಕನ್ನಡ
Македонски
Norsk bokmål
Polski
Português
Română
Русский
Srpskohrvatski / српскохрватски
Српски / srpski
Svenska
தமிழ்
Українська
中文
Koppelingen bewerken
Deze pagina is het laatst bewerkt op 26 feb 2015 om 14:15.
De tekst is beschikbaar onder de licentie Creative Commons Naamsvermelding/Gelijk delen, er kunnen aanvullende voorwaarden van toepassing zijn. Zie de gebruiksvoorwaarden voor meer informatie.
Wikipedia® is een geregistreerd handelsmerk van de Wikimedia Foundation, Inc., een organisatie zonder winstoogmerk.
De weg van de minste weerstand kies ik ten minste niet.quote:
Alsof hij het niet leest.
Maar jij hebt vast ook nooit iets gezegd over een user die er op dat moment niet was, want zo'n hypocriet ben je vast niet.
Jij typt tantoe snel.quote:
[..]
High-performance liquid chromatography
Kolom in een HPLC-opstelling
High-performance liquid chromatography (HPLC) is een scheidingsmethode; het is vloeistofchromatografie waarbij de eluens onder hoge druk door een sterk gepakte kolom wordt gepompt.
De druk kan voor normale HPLC oplopen tot zo'n 200 bar. Voor UHPLC (Ultra High performance Liquid Chromatography) kan de druk zelfs zo'n 1000 bar of meer zijn. Door de hoge druk en het goede contact met de stationaire fase wordt een relatief grote snelheid bereikt van de scheiding, en een zeer goede resolutie. Een typische looptijd voor de meting van één monster met HPLC ligt tussen de 5 en 60 minuten.
Inhoud [verbergen]
1 Principe
2 Scheidingsmethoden
2.1 Normal Phase chromatografie
2.1.1 Hydrophilic-Interaction Liquid Chromatography (HILIC)
2.2 Reversed Phase chromatografie
2.2.1 Paired-Ion Chromatography
2.2.2 Hydrophobic-Interaction Chromatography (HIC)
2.3 Ion-Exchange Chromatography (IEC)
2.4 Chirale chromatografie
3 Detectiemethoden
4 Kolomeigenschappen
5 Kwantificering
6 Autosampler
7 Referenties
Principe[bewerken]
Het monster wordt geïnjecteerd met een injector. Deze injector is een soort kraan met een loop eraan, een lus met een nauwkeurig bekend volume (gewoonlijk 5μl-5mL). Met een injectiespuit vult men deze loop, waarna de stand van de kraan wordt gedraaid, zodat het monster in het systeem wordt geïnjecteerd. Hierna gaat het monster mee met de mobiele fase door de kolom. Door de relatief hoge snelheid van de mobiele fase vindt er nauwelijks diffusie plaats van het monster in het oplosmiddel.
De snelheid waarmee de componenten van het monster de kolom passeren kan beïnvloed worden door een modifier die de elutie versnelt, toe te voegen aan de mobiele fase. Het percentage modifier kan gedurende de hele analyse gelijk blijven (isocratische chromatografie) of gedurende de analyse oplopen (gradiënt).
De toegepaste modifier is afhankelijk van het type chromatografie.
Type chromatografie Veelgebruikte basiseluensen Veelgebruikte modifiers
Reversed phase chromatografie Water, eventueel met bufferzouten en/of andere hulpstoffen Methanol, acetonitril
Normal phase chromatografie Hexaan (of vergelijkbare alkanen), methanol, acetonitril Water, methanol, acetonitril
Ion-Exchange chromatografie Oplossingen van natriumhydroxide, natriumcarbonaat en andere zouten Oplossingen van natriumacetaat, natriumwaterstofcarbonaat en andere zouten
Andere factoren die van belang zijn bij de scheiding zijn: samenstelling van het eluens (pH, toevoeging van hulpstoffen), kolomtype, doorstroomsnelheid (flow), lengte van de leidingen.
Scheidingsmethoden[bewerken]
De binnenkant van de kolom, de stationaire fase, is gevuld met een pakking van kleine bolletjes. Deze pakking is meestal van silica, maar andere materialen komen ook voor. De grootte van de bolletjes is afhankelijk van het type kolom, maar diameters tussen 3 μm en 5 μm zijn het meest gebruikelijk. Kleinere deeltjes geven een betere scheiding dan grotere deeltjes, maar ook een hogere druk. De consequentie daarvan is dat er bij een kolom met grote deeltjes meer ruimte is om de flow te variëren. De bolletjes zijn 'bekleed' (chemisch gebonden) met een actieve laag die een interactie aangaat met de mobiele fase en de componenten van het te analyseren monster.
Normal Phase chromatografie[bewerken]
Bij Normal Phase HPLC is de pakking van de kolom polair en de mobiele fase apolair. Daardoor hebben polaire componenten een sterkere interactie met de stationaire fase dan apolaire componenten. Apolaire componenten komen dus sneller van de kolom af dan polaire componenten. Vanwege het hoge verbruik van organische oplosmiddelen wordt Normal Phase HPLC nog maar weinig toegepast, voor de meeste toepassingen bestaat een milieuvriendelijker Reversed Phase alternatief.
Hydrophilic-Interaction Liquid Chromatography (HILIC)[bewerken]
HILIC is een variant op Normal Phase HPLC. Bij NPLC wordt als mobiele fase een apolair oplosmiddel gebruikt. Dit brengt het probleem met zich mee dat sommige stoffen zo hydrofiel zijn dat ze niet meer van de kolom afkomen. Door minder dan 20% water toe te voegen aan het eluens kan er echter voor gezorgd worden dat ook deze stoffen van de kolom afkomen. Door de competitie van het water en de stoffen voor binding aan de kolom, worden alle stoffen uiteindelijk van de kolom verdreven door het water en komen dus in volgorde van toenemende polariteit van de kolom af. Het toevoegen van water kan zowel isocratisch als met een gradiënt gebeuren.
Reversed Phase chromatografie[bewerken]
Bij Reversed Phase HPLC is de polariteit omgekeerd ten opzichte van Normal Phase HPLC; de pakking van de kolom is apolair en de mobiele fase is polair. Het gevolg daarvan is dat de volgorde van elutie van de verschillende componenten ook omgekeerd is ten opzichte van Normal Phase HPLC: polaire componenten komen sneller van de kolom af dan apolaire componenten.
Paired-Ion Chromatography[bewerken]
Deze techniek wordt gebruikt om met een Reversed Phase kolom, sterk polaire stoffen te scheiden. Normaal zouden de stoffen helemaal niet binden aan de stationaire fase van de kolom, omdat die apolair is. Hierdoor vindt er ook geen scheiding plaats, ze komen namelijk allemaal even snel van de kolom af. Wanneer aanpassing van de pH van de mobiele fase niet voldoende is om de polariteit van de stoffen te laten afnemen, kan er een Ion Pairing Reagent worden toegevoegd aan de mobiele fase.
Een Ion Pairing reagent is een stof die bestaat uit een koolstofketen en een functionele groep waarvan de lading tegenovergesteld is aan de analyte die gescheiden moet worden. De analiet en de ion pairing reagent vormen een "geneutraliseerd" ionenpaar, dat minder polair is en redelijk stabiel. Doordat dit ionenpaar minder polair is blijft het aan de stationaire fase zitten en hierdoor kan het gescheiden worden.
Hydrophobic-Interaction Chromatography (HIC)[bewerken]
Deze methode is een variant van Reversed Phase HPLC een wordt veelal toegepast bij de scheiding van eiwitten. Voor een goede detectie van de verschillende eiwitten is het noodzakelijk dat deze in een waterige oplossing blijven en niet in aanraking komen met oplosmiddelen of oppervlakken die hen kunnen denatureren. Door een zoutgradiënt aan te leggen met hoge zoutgehalten in het begin, wordt het evenwicht van de eiwitten tussen mobiele fase en stationaire fase richting de stationaire fase gedreven. Door het zoutgehalte vervolgens langzaam te verlagen, komen de eiwitten weer van de kolom af.
Ion-Exchange Chromatography (IEC)[bewerken]
In het voorafgaande hebben we gezien dat scheiding met behulp van een HPLC meestal plaatsvindt op basis van polariteit, waarbij polaire stoffen een grote affiniteit voor elkaar hebben, maar niet voor apolaire stoffen. Bij ionchromatografie op basis van elektrische lading is dit precies andersom. Positieve lading stoot immers positieve lading af en trekt juist negatieve lading aan. De stationaire fasen in IEC worden gekarakteriseerd door de sterkte van de zure of basische groepen en het soort ionen dat ze binden.
Kationuitwisseling wordt gebruikt om positief geladen ionen (kationen) te binden aan een negatief oppervlak en anionuitwisseling om negatief geladen ionen (anionen) te binden aan een positief oppervlak. Om zwakke zuren of basen van elkaar te scheiden wordt gebruikgemaakt van sterke ion exchangers, die hun lading behouden binnen een groot pH bereik. De zwakke zuren of basen worden dus in geïoniseerde vorm op de kolom gebracht, waardoor ze aan de stationaire fase kunnen binden. Vervolgens wordt de pH van de mobiele fase zo aangepast dat stof neutraal wordt. De stationaire fase blijft echter geladen, omdat deze sterke zure of basische groepen heeft. Hierdoor verdwijnt de affiniteit tussen de stof en de stationaire fase en komt deze stof van de kolom af.
Bij de scheiding van sterke zuren of basen wordt het principe precies omgekeerd en wordt er gebruikgemaakt van een stationaire fase met zwakke zure of basische groepen. Hierdoor wordt de stationaire fase neutraal, wanneer de pH wordt veranderd en verdwijnt wederom de affiniteit tussen de stof en de stationaire fase, waardoor deze van de kolom afkomt.
Chirale chromatografie[bewerken]
Wanneer de structuurformule van de te analyseren stof een asymmetrisch koolstofatoom bevat betekent dit meestal dat de stof aanwezig is in een mengsel van R en S enantiomeren. Dit mengsel is met een normale kolom niet te onderscheiden, omdat ze in gelijke mate binden aan de stationaire fase. De twee stoffen komen dan gelijkertijd van de kolom en geven maar één piek bij de detector. Dit kan wel met een chirale kolom waarin ook de stationaire fase uit enantiomeren bestaat. De scheiding wordt veroorzaakt door de reversibele bindingen van R (analiet) / R (stationaire fase en S (analiet) / S (stationaire fase) waarvan de stabiliteit iets verschilt. Het verschil in stabiliteit van de binding leidt ertoe dat er een scheiding plaatsvindt en dat er uiteindelijk twee pieken ontstaan.
Detectiemethoden[bewerken]
1rightarrow blue.svg Zie Detector (chromatografie) voor het hoofdartikel over dit onderwerp.
De chromatografie is belangrijk om de compositie van het monster te bepalen, maar om de concentratie van het monster te bepalen is er een bepaalde detector nodig. Er zijn verschillenden detectoren voor HPLC. Enkele veelgebruikte zijn de volgende:
Spectrofotometrie: Meet de absorptie van licht bij een specifieke golflengte
Fluorescentiedetector: meet fluorescentie (emissie van licht door aangeslagen moleculen)
Brekingsindexdetector
Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)
Massaspectrometrie
Kolomeigenschappen[bewerken]
Eigenschap Invloed op de scheiding
Kolomdiameter Kolommen met een kleine diameter geven smallere en hogere pieken dan kolommen met een grote diameter. Daardoor is de detectielimiet lager. Kolommen met een kleine diameter zijn geschikt voor monsters waarin de concentratie van de te analyseren stof laag is. Als de concentratie van de te analyseren stof hoog is kan beter een kolom met een grote diameter gebruikt worden omdat anders overbelading van de kolom op kan treden.
Kolomlengte Een lange kolom geeft een betere scheiding dan een korte kolom. Daarom zijn lange kolommen geschikt voor monsters die veel verschillende componenten bevatten of wanneer er twee componenten met een klein polariteitsverschil gescheiden moeten worden.
Deeltjesgrootte Een kolom met kleine deeltjes geeft een betere scheiding, maar ook een hogere druk en is dus niet geschikt voor hoge flows. Kolommen met grote deeltjes zijn vooral geschikt wanneer snelheid belangrijker is dan een goede scheiding en voor preparatieve chromatografie.
Pakkingsmateriaal Een C18 kolom is minder polair dan een C8 kolom en heeft dus meer interactie met apolaire moleculen. C8 en C4 kolommen zijn geschikt voor polaire monsters zoals bijvoorbeeld peptiden.
Kwantificering[bewerken]
Hoe hoger de concentratie van de geïnjecteerde verbinding hoe groter het signaal dat door de detector wordt afgegeven. Het signaal heeft de vorm van een piek (in een grafiek) en men gebruikt het gemeten piekoppervlak om concentraties mee te kwantificeren. Door verschillende concentraties van een standaard te injecteren kan een ijklijn geconstrueerd worden. In een ijklijn worden dus de piekoppervlakten uitgezet tegen de bekende bijbehorende concentraties. Als van dezelfde verbinding met een onbekende concentratie het piekoppervlak wordt bepaald, wordt die waarde geïnterpoleerd in de ijklijn en wordt aldus de concentratie bepaald. De gevonden concentraties moeten nog omgerekend worden naar volume- of gewichtseenheden.
Autosampler[bewerken]
Een autosampler is een robot die de monsters injecteert op de HPLC-kolom. Injecties door een autosampler zijn nauwkeuriger en reproduceerbaarder dan handmatige injecties en daarnaast is het met een autosampler mogelijk om meerdere monsters achter elkaar te meten zonder dat menselijke interventie noodzakelijk is. Een autosampler kan geprogrammeerd worden met behulp van de elektronica van de HPLC zelf of met behulp van een chromatografiedatasysteem.
Referenties[bewerken]
Rouessac, F. and A., Chemical Analysis, Second Edition, John Wiley and Sons, Ltd – University of Le Mans, France 2007, first printing, pag. 80-86, ISBN 978-0-470-85902-5
Scott R.P.W., 2008, fluorescence detector, geraadpleegd op 17-06-2010
Categorie: Chromatografie
Navigatiemenu
Niet aangemeldOverlegBijdragenRegistrerenAanmeldenArtikelOverlegLezenBewerkenGeschiedenis
Zoeken
Artikel
Hoofdpagina
Vind een artikel
Vandaag
Etalage
Categorieën
Recente wijzigingen
Nieuwe artikelen
Willekeurige pagina
Informatie
Gebruikersportaal
Snelcursus
Hulp en contact
Donaties
Hulpmiddelen
Links naar deze pagina
Verwante wijzigingen
Bestand uploaden
Speciale pagina's
Permanente koppeling
Paginagegevens
Wikidata-item
Deze pagina citeren
Afdrukken/exporteren
Boek maken
Downloaden als PDF
Printervriendelijke versie
In andere talen
العربية
Български
Bosanski
Català
Če¨tina
Deutsch
English
Español
Eesti
فارسی
Suomi
Français
עברית
Hrvatski
Magyar
Bahasa Indonesia
Italiano
日本語
ಕನ್ನಡ
Македонски
Norsk bokmål
Polski
Português
Română
Русский
Srpskohrvatski / српскохрватски
Српски / srpski
Svenska
தமிழ்
Українська
中文
Koppelingen bewerken
Deze pagina is het laatst bewerkt op 26 feb 2015 om 14:15.
De tekst is beschikbaar onder de licentie Creative Commons Naamsvermelding/Gelijk delen, er kunnen aanvullende voorwaarden van toepassing zijn. Zie de gebruiksvoorwaarden voor meer informatie.
Wikipedia® is een geregistreerd handelsmerk van de Wikimedia Foundation, Inc., een organisatie zonder winstoogmerk.
Oké.quote:
[..]
High-performance liquid chromatography
Kolom in een HPLC-opstelling
High-performance liquid chromatography (HPLC) is een scheidingsmethode; het is vloeistofchromatografie waarbij de eluens onder hoge druk door een sterk gepakte kolom wordt gepompt.
De druk kan voor normale HPLC oplopen tot zo'n 200 bar. Voor UHPLC (Ultra High performance Liquid Chromatography) kan de druk zelfs zo'n 1000 bar of meer zijn. Door de hoge druk en het goede contact met de stationaire fase wordt een relatief grote snelheid bereikt van de scheiding, en een zeer goede resolutie. Een typische looptijd voor de meting van één monster met HPLC ligt tussen de 5 en 60 minuten.
Inhoud [verbergen]
1 Principe
2 Scheidingsmethoden
2.1 Normal Phase chromatografie
2.1.1 Hydrophilic-Interaction Liquid Chromatography (HILIC)
2.2 Reversed Phase chromatografie
2.2.1 Paired-Ion Chromatography
2.2.2 Hydrophobic-Interaction Chromatography (HIC)
2.3 Ion-Exchange Chromatography (IEC)
2.4 Chirale chromatografie
3 Detectiemethoden
4 Kolomeigenschappen
5 Kwantificering
6 Autosampler
7 Referenties
Principe[bewerken]
Het monster wordt geïnjecteerd met een injector. Deze injector is een soort kraan met een loop eraan, een lus met een nauwkeurig bekend volume (gewoonlijk 5μl-5mL). Met een injectiespuit vult men deze loop, waarna de stand van de kraan wordt gedraaid, zodat het monster in het systeem wordt geïnjecteerd. Hierna gaat het monster mee met de mobiele fase door de kolom. Door de relatief hoge snelheid van de mobiele fase vindt er nauwelijks diffusie plaats van het monster in het oplosmiddel.
De snelheid waarmee de componenten van het monster de kolom passeren kan beïnvloed worden door een modifier die de elutie versnelt, toe te voegen aan de mobiele fase. Het percentage modifier kan gedurende de hele analyse gelijk blijven (isocratische chromatografie) of gedurende de analyse oplopen (gradiënt).
De toegepaste modifier is afhankelijk van het type chromatografie.
Type chromatografie Veelgebruikte basiseluensen Veelgebruikte modifiers
Reversed phase chromatografie Water, eventueel met bufferzouten en/of andere hulpstoffen Methanol, acetonitril
Normal phase chromatografie Hexaan (of vergelijkbare alkanen), methanol, acetonitril Water, methanol, acetonitril
Ion-Exchange chromatografie Oplossingen van natriumhydroxide, natriumcarbonaat en andere zouten Oplossingen van natriumacetaat, natriumwaterstofcarbonaat en andere zouten
Andere factoren die van belang zijn bij de scheiding zijn: samenstelling van het eluens (pH, toevoeging van hulpstoffen), kolomtype, doorstroomsnelheid (flow), lengte van de leidingen.
Scheidingsmethoden[bewerken]
De binnenkant van de kolom, de stationaire fase, is gevuld met een pakking van kleine bolletjes. Deze pakking is meestal van silica, maar andere materialen komen ook voor. De grootte van de bolletjes is afhankelijk van het type kolom, maar diameters tussen 3 μm en 5 μm zijn het meest gebruikelijk. Kleinere deeltjes geven een betere scheiding dan grotere deeltjes, maar ook een hogere druk. De consequentie daarvan is dat er bij een kolom met grote deeltjes meer ruimte is om de flow te variëren. De bolletjes zijn 'bekleed' (chemisch gebonden) met een actieve laag die een interactie aangaat met de mobiele fase en de componenten van het te analyseren monster.
Normal Phase chromatografie[bewerken]
Bij Normal Phase HPLC is de pakking van de kolom polair en de mobiele fase apolair. Daardoor hebben polaire componenten een sterkere interactie met de stationaire fase dan apolaire componenten. Apolaire componenten komen dus sneller van de kolom af dan polaire componenten. Vanwege het hoge verbruik van organische oplosmiddelen wordt Normal Phase HPLC nog maar weinig toegepast, voor de meeste toepassingen bestaat een milieuvriendelijker Reversed Phase alternatief.
Hydrophilic-Interaction Liquid Chromatography (HILIC)[bewerken]
HILIC is een variant op Normal Phase HPLC. Bij NPLC wordt als mobiele fase een apolair oplosmiddel gebruikt. Dit brengt het probleem met zich mee dat sommige stoffen zo hydrofiel zijn dat ze niet meer van de kolom afkomen. Door minder dan 20% water toe te voegen aan het eluens kan er echter voor gezorgd worden dat ook deze stoffen van de kolom afkomen. Door de competitie van het water en de stoffen voor binding aan de kolom, worden alle stoffen uiteindelijk van de kolom verdreven door het water en komen dus in volgorde van toenemende polariteit van de kolom af. Het toevoegen van water kan zowel isocratisch als met een gradiënt gebeuren.
Reversed Phase chromatografie[bewerken]
Bij Reversed Phase HPLC is de polariteit omgekeerd ten opzichte van Normal Phase HPLC; de pakking van de kolom is apolair en de mobiele fase is polair. Het gevolg daarvan is dat de volgorde van elutie van de verschillende componenten ook omgekeerd is ten opzichte van Normal Phase HPLC: polaire componenten komen sneller van de kolom af dan apolaire componenten.
Paired-Ion Chromatography[bewerken]
Deze techniek wordt gebruikt om met een Reversed Phase kolom, sterk polaire stoffen te scheiden. Normaal zouden de stoffen helemaal niet binden aan de stationaire fase van de kolom, omdat die apolair is. Hierdoor vindt er ook geen scheiding plaats, ze komen namelijk allemaal even snel van de kolom af. Wanneer aanpassing van de pH van de mobiele fase niet voldoende is om de polariteit van de stoffen te laten afnemen, kan er een Ion Pairing Reagent worden toegevoegd aan de mobiele fase.
Een Ion Pairing reagent is een stof die bestaat uit een koolstofketen en een functionele groep waarvan de lading tegenovergesteld is aan de analyte die gescheiden moet worden. De analiet en de ion pairing reagent vormen een "geneutraliseerd" ionenpaar, dat minder polair is en redelijk stabiel. Doordat dit ionenpaar minder polair is blijft het aan de stationaire fase zitten en hierdoor kan het gescheiden worden.
Hydrophobic-Interaction Chromatography (HIC)[bewerken]
Deze methode is een variant van Reversed Phase HPLC een wordt veelal toegepast bij de scheiding van eiwitten. Voor een goede detectie van de verschillende eiwitten is het noodzakelijk dat deze in een waterige oplossing blijven en niet in aanraking komen met oplosmiddelen of oppervlakken die hen kunnen denatureren. Door een zoutgradiënt aan te leggen met hoge zoutgehalten in het begin, wordt het evenwicht van de eiwitten tussen mobiele fase en stationaire fase richting de stationaire fase gedreven. Door het zoutgehalte vervolgens langzaam te verlagen, komen de eiwitten weer van de kolom af.
Ion-Exchange Chromatography (IEC)[bewerken]
In het voorafgaande hebben we gezien dat scheiding met behulp van een HPLC meestal plaatsvindt op basis van polariteit, waarbij polaire stoffen een grote affiniteit voor elkaar hebben, maar niet voor apolaire stoffen. Bij ionchromatografie op basis van elektrische lading is dit precies andersom. Positieve lading stoot immers positieve lading af en trekt juist negatieve lading aan. De stationaire fasen in IEC worden gekarakteriseerd door de sterkte van de zure of basische groepen en het soort ionen dat ze binden.
Kationuitwisseling wordt gebruikt om positief geladen ionen (kationen) te binden aan een negatief oppervlak en anionuitwisseling om negatief geladen ionen (anionen) te binden aan een positief oppervlak. Om zwakke zuren of basen van elkaar te scheiden wordt gebruikgemaakt van sterke ion exchangers, die hun lading behouden binnen een groot pH bereik. De zwakke zuren of basen worden dus in geïoniseerde vorm op de kolom gebracht, waardoor ze aan de stationaire fase kunnen binden. Vervolgens wordt de pH van de mobiele fase zo aangepast dat stof neutraal wordt. De stationaire fase blijft echter geladen, omdat deze sterke zure of basische groepen heeft. Hierdoor verdwijnt de affiniteit tussen de stof en de stationaire fase en komt deze stof van de kolom af.
Bij de scheiding van sterke zuren of basen wordt het principe precies omgekeerd en wordt er gebruikgemaakt van een stationaire fase met zwakke zure of basische groepen. Hierdoor wordt de stationaire fase neutraal, wanneer de pH wordt veranderd en verdwijnt wederom de affiniteit tussen de stof en de stationaire fase, waardoor deze van de kolom afkomt.
Chirale chromatografie[bewerken]
Wanneer de structuurformule van de te analyseren stof een asymmetrisch koolstofatoom bevat betekent dit meestal dat de stof aanwezig is in een mengsel van R en S enantiomeren. Dit mengsel is met een normale kolom niet te onderscheiden, omdat ze in gelijke mate binden aan de stationaire fase. De twee stoffen komen dan gelijkertijd van de kolom en geven maar één piek bij de detector. Dit kan wel met een chirale kolom waarin ook de stationaire fase uit enantiomeren bestaat. De scheiding wordt veroorzaakt door de reversibele bindingen van R (analiet) / R (stationaire fase en S (analiet) / S (stationaire fase) waarvan de stabiliteit iets verschilt. Het verschil in stabiliteit van de binding leidt ertoe dat er een scheiding plaatsvindt en dat er uiteindelijk twee pieken ontstaan.
Detectiemethoden[bewerken]
1rightarrow blue.svg Zie Detector (chromatografie) voor het hoofdartikel over dit onderwerp.
De chromatografie is belangrijk om de compositie van het monster te bepalen, maar om de concentratie van het monster te bepalen is er een bepaalde detector nodig. Er zijn verschillenden detectoren voor HPLC. Enkele veelgebruikte zijn de volgende:
Spectrofotometrie: Meet de absorptie van licht bij een specifieke golflengte
Fluorescentiedetector: meet fluorescentie (emissie van licht door aangeslagen moleculen)
Brekingsindexdetector
Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)
Massaspectrometrie
Kolomeigenschappen[bewerken]
Eigenschap Invloed op de scheiding
Kolomdiameter Kolommen met een kleine diameter geven smallere en hogere pieken dan kolommen met een grote diameter. Daardoor is de detectielimiet lager. Kolommen met een kleine diameter zijn geschikt voor monsters waarin de concentratie van de te analyseren stof laag is. Als de concentratie van de te analyseren stof hoog is kan beter een kolom met een grote diameter gebruikt worden omdat anders overbelading van de kolom op kan treden.
Kolomlengte Een lange kolom geeft een betere scheiding dan een korte kolom. Daarom zijn lange kolommen geschikt voor monsters die veel verschillende componenten bevatten of wanneer er twee componenten met een klein polariteitsverschil gescheiden moeten worden.
Deeltjesgrootte Een kolom met kleine deeltjes geeft een betere scheiding, maar ook een hogere druk en is dus niet geschikt voor hoge flows. Kolommen met grote deeltjes zijn vooral geschikt wanneer snelheid belangrijker is dan een goede scheiding en voor preparatieve chromatografie.
Pakkingsmateriaal Een C18 kolom is minder polair dan een C8 kolom en heeft dus meer interactie met apolaire moleculen. C8 en C4 kolommen zijn geschikt voor polaire monsters zoals bijvoorbeeld peptiden.
Kwantificering[bewerken]
Hoe hoger de concentratie van de geïnjecteerde verbinding hoe groter het signaal dat door de detector wordt afgegeven. Het signaal heeft de vorm van een piek (in een grafiek) en men gebruikt het gemeten piekoppervlak om concentraties mee te kwantificeren. Door verschillende concentraties van een standaard te injecteren kan een ijklijn geconstrueerd worden. In een ijklijn worden dus de piekoppervlakten uitgezet tegen de bekende bijbehorende concentraties. Als van dezelfde verbinding met een onbekende concentratie het piekoppervlak wordt bepaald, wordt die waarde geïnterpoleerd in de ijklijn en wordt aldus de concentratie bepaald. De gevonden concentraties moeten nog omgerekend worden naar volume- of gewichtseenheden.
Autosampler[bewerken]
Een autosampler is een robot die de monsters injecteert op de HPLC-kolom. Injecties door een autosampler zijn nauwkeuriger en reproduceerbaarder dan handmatige injecties en daarnaast is het met een autosampler mogelijk om meerdere monsters achter elkaar te meten zonder dat menselijke interventie noodzakelijk is. Een autosampler kan geprogrammeerd worden met behulp van de elektronica van de HPLC zelf of met behulp van een chromatografiedatasysteem.
Referenties[bewerken]
Rouessac, F. and A., Chemical Analysis, Second Edition, John Wiley and Sons, Ltd – University of Le Mans, France 2007, first printing, pag. 80-86, ISBN 978-0-470-85902-5
Scott R.P.W., 2008, fluorescence detector, geraadpleegd op 17-06-2010
Categorie: Chromatografie
Navigatiemenu
Niet aangemeldOverlegBijdragenRegistrerenAanmeldenArtikelOverlegLezenBewerkenGeschiedenis
Zoeken
Artikel
Hoofdpagina
Vind een artikel
Vandaag
Etalage
Categorieën
Recente wijzigingen
Nieuwe artikelen
Willekeurige pagina
Informatie
Gebruikersportaal
Snelcursus
Hulp en contact
Donaties
Hulpmiddelen
Links naar deze pagina
Verwante wijzigingen
Bestand uploaden
Speciale pagina's
Permanente koppeling
Paginagegevens
Wikidata-item
Deze pagina citeren
Afdrukken/exporteren
Boek maken
Downloaden als PDF
Printervriendelijke versie
In andere talen
العربية
Български
Bosanski
Català
Če¨tina
Deutsch
English
Español
Eesti
فارسی
Suomi
Français
עברית
Hrvatski
Magyar
Bahasa Indonesia
Italiano
日本語
ಕನ್ನಡ
Македонски
Norsk bokmål
Polski
Português
Română
Русский
Srpskohrvatski / српскохрватски
Српски / srpski
Svenska
தமிழ்
Українська
中文
Koppelingen bewerken
Deze pagina is het laatst bewerkt op 26 feb 2015 om 14:15.
De tekst is beschikbaar onder de licentie Creative Commons Naamsvermelding/Gelijk delen, er kunnen aanvullende voorwaarden van toepassing zijn. Zie de gebruiksvoorwaarden voor meer informatie.
Wikipedia® is een geregistreerd handelsmerk van de Wikimedia Foundation, Inc., een organisatie zonder winstoogmerk.
Onterechte TR, ik ken iemand die zo 50 topics per dag maaktquote:
Gewoon beflapje erop leggen. Kan toch best.quote:
[..]
Ik wil pas kinderen op mn 27e srry
idem.quote:
Dat had die smeagol gedaan tochquote:
[..]
Waarschijnlijk krulde hoink zijn snor nog harder dan normaal en kopieerde hij woest die post naar zijn holmaatje. Zo gaat dat in die kringen, als iemand op FOK! iets over je ex zegt dan stuur je haar gewoon even een bericht op FB ook.
Nieuwe fok dieptepunt
En dan als iemand geen (lange) reactie geeft op zo'n post omdat ze geen fuck geven dan streelt hij voldaan zijn snorretje en denkt hij 'heb ik hem toch even mooi te pakken daar!'.quote:
[..]
Gewoon hem aldoor al zijn getracht-intellectuele-hersenscheten laten plempen, is hij weer blij.. verder gewoon negeren en om lachen. Want je moet er wel om kunnen lachen zo 1 toch...
toch?
Beflapje is meest onromantische ding dat er bestaatquote:
[..]
Gewoon beflapje erop leggen. Kan toch best.
ja maar ik tr omdat jij het bentquote:
[..]
Onterechte TR, ik ken iemand die zo 50 topics per dag maakt
Hermannquote:
Nou wat gemeen, heb jou nooit wat misdaanquote:
hahaha zo moet je het wel voor je zien iddquote:
[..]
En dan als iemand geen (lange) reactie geeft op zo'n post omdat ze geen fuck geven dan streelt hij voldaan zijn snorretje en denkt hij 'heb ik hem toch even mooi te pakken daar!'.
smaegol?quote:
[..]
Dat had die smeagol gedaan toch
Nieuwe fok dieptepunt
vast wel, tis fok tenslottequote:
vrouwen concureren van nature met elkaar om t mannetje te veroveren . Ook al is er dan niet altijd man in de buurt dsn blijven vrouwen in die rol zitten.quote:
[..]
Niet weten dat vrouwen zich mooi opmaken om andere bitches te kop in te drukken.
Nee, smeagolquote:
houv an jequote:
[..]
Nou wat gemeen, heb jou nooit wat misdaan
Zou je wel moeten doen, is het meest efficiënt.quote:
[..]
De weg van de minste weerstand kies ik ten minste niet.
quote:
Gewoon hem aldoor al zijn getracht-intellectuele-hersenscheten laten plempen, is hij weer blij.. verder gewoon negeren en om lachen. Want je moet er wel om kunnen lachen zo 1 toch...
toch?
Tegenstrijdig allemaal hoor, Noot.quote:
Nee, man laat die gare ventjes gewoon in hun sop gaar koken.
Anders is de leef zo saaiquote:
[..]
vrouwen concureren van nature met elkaar om t mannetje te veroveren . Ook al is er dan niet altijd man in de buurt dsn blijven vrouwen in die rol zitten.
Wat natuurlijk totaal zinloos is want gasten gaan 9 van de 10 keer vreemd met vrouwen die lelijker zijn dan hun vriendin.quote:
[..]
vrouwen concureren van nature met elkaar om t mannetje te veroveren . Ook al is er dan niet altijd man in de buurt dsn blijven vrouwen in die rol zitten.
Ohh, dacht al.. laat dan maar idd.quote:
We zijn geen dierenquote:
Lijkt wel volle Maan aan het gedrag van mensen te merken.
Ja? oh.quote:
[..]
[..]
Tegenstrijdig allemaal hoor, Noot.
laat vampier Damon maar komenquote:
Lijkt wel volle Maan aan het gedrag van mensen te merken.
Nee, maar ook op mensen heeft het invloed.quote:
Niels is wel een beest. Een seksbeest.quote:
SPOILER
Oh oh ohquote:
[..]
Wat natuurlijk totaal zinloos is want gasten gaan 9 van de 10 keer vreemd met vrouwen die lelijker zijn dan hun vriendin.
Omg een jongen had echt doutzen look a like vriendin ging die vreemd met een fatsig amerikaantje zo uit de Walmart
Gelijk even peilen of er medestanders zijn.quote:
Zou je wel moeten doen, is het meest efficiënt.
truequote:
[..]
Wat natuurlijk totaal zinloos is want gasten gaan 9 van de 10 keer vreemd met vrouwen die lelijker zijn dan hun vriendin.
Ex van cyquote:
Gewoon one man army.quote:
[..]
Gelijk even peilen of er medestanders zijn.
Dat ligt meer aan een volle zak.quote:
Lijkt wel volle Maan aan het gedrag van mensen te merken.
Hoe verklaar je dit?quote:
[..]
Wat natuurlijk totaal zinloos is want gasten gaan 9 van de 10 keer vreemd met vrouwen die lelijker zijn dan hun vriendin.
panz?quote:
Dan loop ik stilletjes weg uit zijn leven lkkr overal op blokkeren zodat hij nooit zijn verhaal kan doen.
Veel volle zakken hier dan.quote:
P0rn. Ze denken bij smerige wijven natuurlijk dat ze ruige seks krijgen.quote:
MMMMMMMMMMMMMMMMMMquote:
Ja we wonen allemaal in de wildernis zonder buurvrouw, dan krijg je dat.quote:
Hahaquote:
[..]
Niels is wel een beest. Een seksbeest.SPOILER
Meelopertje dus. Beetje kneuzig dit Catkiller.quote:
Zonder buuv'? Damn.quote:
[..]
Ja we wonen allemaal in de wildernis zonder buurvrouw, dan krijg je dat.
Hoe kan ik een meeloper zijn als ik een one man army ben?quote:
[..]
Meelopertje dus. Beetje kneuzig dit Catkiller.
Nee anderequote:
Wa zeggie?quote:
Ik behoor zeker weer tot niet nader te noemen krijgen, dus nu moet ik weer het een en ander gaan doorsturen.
Oh dacht dat al die knappere wijven dan bitches moesten zijn ofzoquote:
[..]
P0rn. Ze denken bij smerige wijven natuurlijk dat ze ruige seks krijgen.
iets wat nooit iemand gebruikt.quote:
Mag ik van ganze harte hopen.
EN DAN TIG X ZELFDE DING
Dat beweert iedereen hier te zijn, maar ondertussen zie je ze dan vuistdiep zakken.quote:
[..]
Hoe kan ik een meeloper zijn als ik een one man army ben?
ohquote:
nog meer fokkers als ex. lolGoogle het eensquote:
Srsly een zacht lapje.
ander woord voor boterhamzakjequote:
One man army represent.quote:
[..]
Dat beweert iedereen hier te zijn, maar ondertussen zie je ze dan vuistdiep zakken.
toch beter dan jullie allemaal bij elkaar
Nou ik las er eens een artikel over. Mensen gingen het voor eerste x gebruiken en praaachtige recensies.quote:
[..]
iets wat nooit iemand gebruikt.
Mag ik van ganze harte hopen.
Wrm zijn turkse wijven altijd irritantquote:
Tsjogejonge wat houden jullie ervan om te roddelen over cy en panz en weetikveel wie nog meer
EN DAN TIG X ZELFDE DING
Het hoogste goed hier. En alsnog even bijval zoeken naderhand. Want direct tegen mij zeg je dit niet.quote:
En dan als iemand geen (lange) reactie geeft op zo'n post omdat ze geen fuck geven dan streelt hij voldaan zijn snorretje en denkt hij 'heb ik hem toch even mooi te pakken daar!'.
Maar ze is ook kaasquote:
[..]
Wrm zijn turkse wijven altijd irritant
Tfoequote:
Da's het ergste.quote:
Daar krijg je toch spontaan een slappe vanquote:
[..]
Nou ik las er eens een artikel over. Mensen gingen het voor eerste x gebruiken en praaachtige recensies.
Omdat je term weer eens verkeerd gekozen is.quote:
Hoe kan ik een meeloper zijn als ik een one man army ben?
Misschien omdat jij er bent weetje negatieve invloedquote:
[..]
Wrm zijn turkse wijven altijd irritant
Nice, dat heb ik gemist hier
Jankse he.quote:
[..]
Het hoogste goed hier. En alsnog even bijval zoeken naderhand. Want direct tegen mij zeg je dit niet.
Ja nou het is ook niet bedoeld voor een lul hequote:
[..]
Daar krijg je toch spontaan een slappe van
Gewoon groepsdier hoor.quote:
Dat beweert iedereen hier te zijn, maar ondertussen zie je ze dan vuistdiep zakken.
Idd, omdat wel allemaal beven van angst omdat je ons kneus noemtquote:
[..]
Het hoogste goed hier. En alsnog even bijval zoeken naderhand. Want direct tegen mij zeg je dit niet.
de mooiste reactie van jou krijg je zo Precies. One man army hoor.quote:
Joh. Maar je snapt me wel. je geilheid zakt toch wel door de vloer heen als iemand met een beflapje aan komtquote:
[..]
Ja nou het is ook niet bedoeld voor een lul he
Keelkanker of beflapjequote:
[..]
Joh. Maar je snapt me wel. je geilheid zakt toch wel door de vloer heen als iemand met een beflapje aan komt
quote:
Waarom zou je zo'n ding gebruiken dan , er valt niks op te vangen toch, of wtf
Zal je vanaf nu nooit meer quoten als ik het over jou heb omdat het je blijkbaar veel doet. Hoop dat je geen enkele post mist.quote:
Ondertussen wel lekker met boze vingertjes onder werktijd wachten totdat je weer een vale snor-opmerking kunt plaatsen. Meesterlijkquote:
Idd, omdat wel allemaal beven van angst omdat je ons kneus noemt
Echt hequote:
Dit hele gedoe hier... Mensen nemen het Fokleven echt te serieus ofzo.
HAHAHAHAHAHAHAAH AGAHHAquote:
GODVERDOMME HARD GELACHEN
Niet de Rode Zee leegbeffen.quote:
Waarom zou je zo'n ding gebruiken dan , er valt niks op te vangen toch, of wtf
NIELS DOE GODVERDOMME NORMAAL MANquote:
[ Bericht 1% gewijzigd door #ANONIEM op 26-01-2016 16:24:23 ]
Dan is de keuze makkelijk.quote:
Jij begrijpt het man!quote:
[..]
Ondertussen wel lekker met boze vingertjes onder werktijd wachten totdat je weer een vale snor-opmerking kunt plaatsen. Meesterlijk
Zulken zijn hier altijd al geweest, dat zijn juist degenen die leven in de brouwerij brengen. Op de verkeerde manier.. maar tochquote:
Dit hele gedoe hier... Mensen nemen het Fokleven echt te serieus ofzo.
Is mooi manquote:
Dit hele gedoe hier... Mensen nemen het Fokleven echt te serieus ofzo.
komquote:
We hebben het erover gehad Hoink. Ik ben geen echte kapitein.quote:
[..]
NIELS DOE GODVERDOMME NORMAAL MAN
Iedereen vindt van de anderen dat ze het te serieus nemen. Iedereen behalve zijzelf.quote:
hey niels ik ben nu ongesteld zullen we ffquote:
Je kiest nu eens een keer in je leven een kant dus. Trots op je hoor one man army.quote:
Zal je vanaf nu nooit meer quoten als ik het over jou heb omdat het je blijkbaar veel doet. Hoop dat je geen enkele post mist.
Alweer?quote:
ja is pas de 4de keerquote:
Wtf is er mis met mijn mobiel
Ze plakken ook altijd zoquote:Op dinsdag 26 januari 2016 16:20 schreef Opsonisatie het volgende:
[..]
Misschien omdat jij er bent weetje negatieve invloed
Nou ja, als t moetquote:
Beter Marokkaanse meiden.quote:
[..]
Wrm zijn turkse wijven altijd irritant
Dus Stim is ook ongesteld?quote:
[..]
hey niels ik ben nu ongesteld zullen we ff
Ik plak iig niet aan jequote:
Hem er in stoppen tijdens de rode week is al kk goor en onnatuurlijk
Hapje eten? Ja ok. Jij kookt toch?quote:
[..]
hey niels ik ben nu ongesteld zullen we ff
Ik kom hier alleen voor fittie. Neem het dus erg serieus.quote:
Iedereen vindt van de anderen dat ze het te serieus nemen. Iedereen behalve zijzelf.
Je moet toch iets te doen hebben tot je pensioen? Zinvol werk doe je toch niet.quote:
Zulken zijn hier altijd al geweest, dat zijn juist degenen die leven in de brouwerij brengen. Op de verkeerde manier.. maar toch
quote:
Werkt whatsapp bij jullie
Wtf is er mis met mijn mobiel
Telegram beste
Nooit het fenomeen "magnetron kutje" meegemaakt?quote:
We hebben het erover gehad Hoink. Ik ben geen echte kapitein.
Je bent er zeker ook zoeen die geen placenta lust?quote:
Rode zee leegbeffen
Hem er in stoppen tijdens de rode week is al kk goor en onnatuurlijk
Dat zijn irritante kuthoeren in het openbaar vervoer.quote:
Wule ile beterquote:
Op alle vlakken
Haha. Wat is dat dan?quote:
[..]
Nooit het fenomeen "magnetron kutje" meegemaakt?
Ach, er zit zeker wel een verschil in. Als je op een willekeurige dag kijkt hier heb je meer kans dat hoink tegen iemand door loopt te zeiken dan dat je mij dat ziet doen, dat weet ik wel zeker. Alleen tegen hoink blijf ik zelf ook door gaan omdat hij er meer van zou genieten als ik direct niks meer zou zeggen en dat gun ik die hipstersnor niet.quote:
[..]
Iedereen vindt van de anderen dat ze het te serieus nemen. Iedereen behalve zijzelf.
Fuck telegramquote:
Als je KLB radio doet, mag je toch wel zeggen dat je het beheuurlijk serieus neemt.quote:
[..]
Ik kom hier alleen voor fittie. Neem het dus erg serieus.
[..]
Je moet toch iets te doen hebben tot je pensioen? Zinvol werk doe je toch niet.
heb je hersenbloeding ofzoquote:
omdat?quote:
zal jou eens laten zien wat een irritante kuthoer isquote:
[..]
Dat zijn irritante kuthoeren in het openbaar vervoer.
?Je laat je nu wel echt kennen btw. Leuk om te zien weer.quote:
[..]
Ik kom hier alleen voor fittie. Neem het dus erg serieus.
[..]
Je moet toch iets te doen hebben tot je pensioen? Zinvol werk doe je toch niet.
quote:
[..]
Als je KLB radio doet, mag je toch wel zeggen dat je het beheuurlijk serieus neemt.
HET IS ALLEMAAL ZO TEGENSTRIJDIG JEZUS MENSEN.quote:Op dinsdag 26 januari 2016 16:28 schreef Catkiller het volgende:
Alleen tegen hoink blijf ik zelf ook door gaan omdat hij er meer van zou genieten als ik direct niks meer zou zeggen en dat gun ik die hipstersnor niet.
Dat het er überhaupt is.quote:
Benieuwd wie je langs gaat sturen.quote:
[..]
zal jou eens laten zien wat een irritante kuthoer is
Ik heb dat nog nooit beluisterd.quote:
[..]
Als je KLB radio doet, mag je toch wel zeggen dat je het beheuurlijk serieus neemt.
Keertje wat fragmenten geluisterd. Was wel een beetjequote:
[..]
Ik heb dat nog nooit beluisterd.
Het kanquote:
Was geen sarcasme hoor.quote:
Je laat je nu wel echt kennen btw. Leuk om te zien weer.
Ging je ook meetekenen enzo?quote:
[..]
Keertje wat fragmenten geluisterd. Was wel een beetje
Ik wil weer dat er fylax friday komtquote:
[..]
Keertje wat fragmenten geluisterd. Was wel een beetje
Laat mij nu maar zien dan hoe vaak ik dat zeg.. doe het nuquote:
echt typisch nootmans als hij niets meer te zggen heeft ''Je laat je weer eens kennen''
er is een search functie. Kom maar.
quote:
echt typisch nootmans als hij niets meer te zggen heeft ''Je laat je weer eens kennen''
Die heeft al topics lang niets meer te zeggen.quote:
"Snor", "Mad", "Projectie".
Nou, nou. Cirkeltje is weer rond.
Oh nou ja denk er nog maar even over na dan. Als je hier enkel komt voor 'fittie' dan is dat best een treurige reden overigens.quote:
[..]
HET IS ALLEMAAL ZO TEGENSTRIJDIG JEZUS MENSEN.
Is dit het medestanders zoeken ding van jou?quote:
[..]
[..]
Die heeft al topics lang niets meer te zeggen.
"Snor", "Mad", "Projectie".
Nou, nou. Cirkeltje is weer rond.
Nou eh je laat je wel kennen nu eh heheheh hehehe ehehequote:
[..]
Laat mij nu maar zien dan hoe vaak ik dat zeg.. doe het nu
Kom maar.
zoek zelf op dan ben hier alleen om mee te genieten. meteen ader in de nek deze man.quote:
[..]
Laat mij nu maar zien dan hoe vaak ik dat zeg.. doe het nu
Kom maar.
Zeker.quote:
[..]
Nou eh je laat je wel kennen nu eh heheheh hehehe ehehe
Gelukkig wel. Dat heet anatomie.quote:
[..]
zoek zelf op dan ben hier alleen om mee te genieten. meteen ader in de nek deze man.