Vaccins #5 - Het zal in Q1 2021

Heeft iemand dat plaatje nog van die leveraantallen per kwartaal.

Hugogod was wel spot on met zijn inschatting.

quote:

Op zaterdag 19 december 2020 14:14 schreef groenen het volgende:
Heeft iemand dat plaatje nog van die leveraantallen per kwartaal.

Hugogod was wel spot on met zijn inschatting.

Een van deze?

Zijn er ook niet net nog 80 mln Moderna vaccins bijgekocht, zie

https://www.hln.be/buiten(...)%2Fwww.google.com%2F

waar Nederland ook gebruik van kan maken?

quote:

Op zaterdag 19 december 2020 14:12 schreef Vallon het volgende:

[..]

Grondstoffen zijn natuurlijk nodig om te produceren. We komen al snel op boeiende verhalen die ingewikkeld simpel van aard zijn. Voor de "bacterie" referentie beroep ik mij o.a. op:
"^{bron: ncbi} ... ...
To initiate the production process, template plasmid DNA produced in Escherichia coli is linearized using a restriction enzyme to allow synthesis of runoff transcripts with a poly(A) tract at the 3′ end. Next, the mRNA is synthesized from NTPs by a DNA-dependent RNA polymerase from bacteriophage (such as T7, SP6, or T3). The template DNA is then degraded by incubation with DNase.
Finally, the mRNA is enzymatically or chemically capped to enable efficient translation in vivo.
mRNA synthesis is highly productive, yielding in excess of 2 g l−1 of full-length mRNA in multi-gram scale reactions under optimized conditions."
Ik lees dit als dat (DNA gemuteerde) E.coli bacterie stammen worden gebruikt uit hun halffabricaten, veel gecodeerd mRNA te kunnen synthetiseren.

Volgens mij gaat dat over in vitro transcriptie, maw: het proces dat normaal in de celkern of nucleoïde plaatsvindt (het "kopiëren" van een gen van DNA naar RNA) uitvoeren in een reageerbuis ipv in een levende cel. Je vertrekt dus van een DNA template, van bestaande "code".
Bij oligonucleotide synthesis daarentegen kan je eender welke code naar het RNA schrijven. je kiest telkens welke base (A, C, G of T of bij RNA: A, C, G of U) je toevoegt aan de keten.
mRNA heeft naast die code nog andere segmenten (cap, tail, untranslated regions..), best mogelijk dat die uit "gekweekte" bronnen (bacteriën, schimmels, dierlijke cel lijnen) komen.

disclaimer: ik kan fout zijn, ben geen bioloog of (bio)chemicus.

quote:

Op zaterdag 19 december 2020 15:24 schreef crystal_meth het volgende:

[..]

Volgens mij gaat dat over in vitro transcriptie, maw: het proces dat normaal in de celkern of nucleoïde plaatsvindt (het "kopiëren" van een gen van DNA naar RNA) uitvoeren in een reageerbuis ipv in een levende cel. Je vertrekt dus van een DNA template, van bestaande "code".
Bij oligonucleotide synthesis daarentegen kan je eender welke code naar het RNA schrijven. je kiest telkens welke base (A, C, G of T of bij RNA: A, C, G of U) je toevoegt aan de keten.
mRNA heeft naast die code nog andere segmenten (cap, tail, untranslated regions..), best mogelijk dat die uit "gekweekte" bronnen (bacteriën, schimmels, dierlijke cel lijnen) komen.

disclaimer: ik kan fout zijn, ben geen bioloog of (bio)chemicus.

Ik wel, al doe ik er sinds mijn afstuderen 15 jaar geleden niets meer mee. Beschouw dat maar als een disclaimer. .

Vermoedelijk wordt oligonucleotide synthese niet gebruikt om de grote hoeveelheden mRNA te produceren die nodig zijn voor het vaccin. Die techniek is mooi om een kunstmatig stukje DNA te produceren dat bv als template kan dienen, maar je hebt voor elk extra nucleotide een reactiestap nodig. Dus 200 stappen voor 200 nucleotiden. Elke stap is niet 100% effectief, dus je totale opbrengst is veel te laag. Ik vraag me zelfs af of op deze manier dit soort vrij lange stukken DNA gemaakt kunnen worden. Enzymen hebben in elk geval de voorkeur. Die zijn veel specifieker, zijn sneller en leveren een compleet eindproduct. Maar ze hebben wel een template nodig.

Ik denk dat het productieproces ruwweg langs deze lijnen loopt:

Eerst moet je een template hebben:
1. Er is een stukje template-DNA gemaakt. Dit kan bijvoorbeeld via oligonucleotide synthese, of via een enzym (reverse transcriptase) op basis van virus-RNA. Dit is dus de DNA-tegenhanger van het mRNA in het vaccin.
2. Dat stukje DNA is in een zgn plasmide geplaatst. Dit is een relatief klein cirkelvormig stuk DNA dat eenvoudig in een E. coli-bacterie geplaatst kan worden. Het blijft dan een losstaand stuk DNA in de bacterie. Een standaardtechniek die al sinds de jaren '70 gebruikt wordt.
3. De E. coli-bacterie met het plasmide vermenigvuldigt zich snel en vaak. De bacteriën maken daarbij ook op grote schaal kopieën van de plasmide.
4. De bacteriën worden gedood, en het plasmide-DNA wordt daaruit gezuiverd. Dat kan eenvoudig, omdat het nog altijd een losstaand stuk DNA is. Eindresultaat: een DNA-template.

Nu de productie van mRNA
5. Het plasmide wordt opengeknipt met een restrictie-enzym, een DNA-knippend enzym. Op die manier kan makkelijk alleen het juiste stuk DNA uit het plasmide afgelezen worden (het template voor het mRNA voor in het vaccin). Aan het template-DNA worden de 4 verschillende nucleotiden toegevoegd en een ander enzym: RNA polymerase. Dit leest het template-DNA af, en produceert met behulp van die nucleotiden de RNA-tegenhanger ervan. Oligonucleotide synthese, maar dan via de biologische weg. . Het plasmide is zo ontworpen dat het template-DNA heel vaak afgelezen gaat worden. Het enzym herhaalt die stap dus heel vaak, waarbij elke keer weer het mRNA geproduceerd wordt.
6. Als er genoeg mRNA is gemaakt wordt het template-DNA afgebroken met een ander enzym dat alleen DNA afbreekt, maar mRNA ongemoeid laat, en de hele handel wordt gezuiverd. Resultaat: zuiver mRNA, dat vervolgens in iets geplaatst wordt (bv vetbolletjes) zodat het uiteindelijk ook veilig in een menselijke cel afgeleverd wordt.

Ter aanvulling hierop: Tozinameram (het Pfizer-vaccin) bevat mRNA met een lengte van 4284 nucleotiden (dit codeert voor het complete spike-eiwit), het DNA-template moet dus ook ongeveer zo lang zijn. Lijkt veel (en is iets meer dan 200 nucleotiden ), maar RNA-polymerase is best snel. Eén enzym produceert een mRNA-molecuul met zo'n lengte in 1 of hooguit enkele minuten. En volgens mij kunnen meerdere RNA-polymerase-enzymen achter elkaar hetzelfde DNA-template aflezen, als een treintje.

quote:

Op zaterdag 19 december 2020 17:27 schreef freako het volgende:

[..]

Ik wel, al doe ik er sinds mijn afstuderen 15 jaar geleden niets meer mee. Beschouw dat maar als een disclaimer. .

Vermoedelijk wordt oligonucleotide synthese niet gebruikt om de grote hoeveelheden mRNA te produceren die nodig zijn voor het vaccin. Die techniek is mooi om een kunstmatig stukje DNA te produceren dat bv als template kan dienen, maar je hebt voor elk extra nucleotide een reactiestap nodig. Dus 200 stappen voor 200 nucleotiden. Elke stap is niet 100% effectief, dus je totale opbrengst is veel te laag. Ik vraag me zelfs af of op deze manier dit soort vrij lange stukken DNA gemaakt kunnen worden.

Tegenwoordig is 200 blijkbaar de gangbare limiet. Het DNA opbouwen en dan RNA "kopieën" maken lijkt inderdaad logischer (efficiënter), al valt de yield van oligonucleotides wel mee: Zo claimt Ultramer een yield van 35% tot 50% voor oligos van 100 nucleotides (tegenover 13% tot 23% bij de concurrentie).
Kostprijs: RNA Oligo, 80 nmol, 60 - 120 bases: 11,00 ¤ per base.

quote:

Enzymen hebben in elk geval de voorkeur. Die zijn veel specifieker, zijn sneller en leveren een compleet eindproduct. Maar ze hebben wel een template nodig.

Ik denk dat het productieproces ruwweg langs deze lijnen loopt:

Eerst moet je een template hebben:
1. Er is een stukje template-DNA gemaakt. Dit kan bijvoorbeeld via oligonucleotide synthese, of via een enzym (reverse transcriptase) op basis van virus-RNA. Dit is dus de DNA-tegenhanger van het mRNA in het vaccin.
2. Dat stukje DNA is in een zgn plasmide geplaatst. Dit is een relatief klein cirkelvormig stuk DNA dat eenvoudig in een E. coli-bacterie geplaatst kan worden. Het blijft dan een losstaand stuk DNA in de bacterie. Een standaardtechniek die al sinds de jaren '70 gebruikt wordt.
3. De E. coli-bacterie met het plasmide vermenigvuldigt zich snel en vaak. De bacteriën maken daarbij ook op grote schaal kopieën van de plasmide.
4. De bacteriën worden gedood, en het plasmide-DNA wordt daaruit gezuiverd. Dat kan eenvoudig, omdat het nog altijd een losstaand stuk DNA is. Eindresultaat: een DNA-template.

Nu de productie van mRNA
5. Het plasmide wordt opengeknipt met een restrictie-enzym, een DNA-knippend enzym. Op die manier kan makkelijk alleen het juiste stuk DNA uit het plasmide afgelezen worden (het template voor het mRNA voor in het vaccin). Aan het template-DNA worden de 4 verschillende nucleotiden toegevoegd en een ander enzym: RNA polymerase. Dit leest het template-DNA af, en produceert met behulp van die nucleotiden de RNA-tegenhanger ervan. Oligonucleotide synthese, maar dan via de biologische weg. . Het plasmide is zo ontworpen dat het template-DNA heel vaak afgelezen gaat worden. Het enzym herhaalt die stap dus heel vaak, waarbij elke keer weer het mRNA geproduceerd wordt.
6. Als er genoeg mRNA is gemaakt wordt het template-DNA afgebroken met een ander enzym dat alleen DNA afbreekt, maar mRNA ongemoeid laat, en de hele handel wordt gezuiverd. Resultaat: zuiver mRNA, dat vervolgens in iets geplaatst wordt (bv vetbolletjes) zodat het uiteindelijk ook veilig in een menselijke cel afgeleverd wordt.

Of ze nog steeds bacteriën gebruiken voor het vermenigvuldigen weet ik niet, ik zou verwachten dat men steeds meer in de richting van "puur chemische" processen gaat, omdat dat flexibeler en "cleaner" is, meer controle biedt, minder variatie, volledig geautomatiseerd kan worden. Je geeft de specificaties in, en het produkt rolt eruit. Dan mis je de exponentiële groei, maar je kan vanaf het begin heel wat tegelijk synthetiseren ( kan je DNA in miljarden bacteriën tegelijk plaatsen, of moet je met één beginnen en dan vermenigvuldigen?).

quote:

Op zaterdag 19 december 2020 19:52 schreef crystal_meth het volgende:

[..]

Of ze nog steeds bacteriën gebruiken voor het vermenigvuldigen weet ik niet, ik zou verwachten dat men steeds meer in de richting van "puur chemische" processen gaat, omdat dat flexibeler en "cleaner" is, meer controle biedt, minder variatie, volledig geautomatiseerd kan worden. Je geeft de specificaties in, en het produkt rolt eruit

[..]

Zie ook mijn opmerking in de post eronder. Voor het spike-eiwit is een DNA-template met een lengte van >4k baseparen/nucleotiden nodig. Om dat elke keer synthetisch-chemisch opnieuw te gaan maken is lastig. Dan heb je 21 stukken van 200 nucleotiden nodig die je vervolgens aan elkaar moet gaan plakken. De benodigde schaal is ook een aantal ordes groter dan 80 nmol vermoed ik voor grootschalige productie.

Het voordeel van het gebruik van bacteriën is dat die geen dure chemicaliën nodig hebben om te groeien en het complete plasmide leveren. Een groeimedium is voldoende. Isoleren van plasmide-DNA uit bacteriën is ook behoorlijk standaard, en levert een schoon resultaat.

quote:

( kan je DNA in miljarden bacteriën tegelijk plaatsen, of moet je met één beginnen en dan vermenigvuldigen?).

Dat plaatsen is niet een heel efficiënt proces. Gelukkig hoeft het maar een keer gedaan te worden, daarna gebruik je steeds afstammelingen van die bacteriën. Bacteriën kun je sowieso prima invriezen in glycerol bij -80 graden, na ontdooien delen die vrolijk verder. Ik meen dat E. coli zich elke 20 minuten deelt onder ideale omstandigheden, dus je kweekt ook snel weer nieuwe voorraad. Bijvoorbeeld via een serie van steeds grotere bioreactoren, of via een continue proces waarbij je steeds een deel van de bacteriën oogst.

Bron zal vast wel ergens in https://www.bloomberg.com(...)global-distribution/ staan, ik kan het zo snel niet vinden.

https://www.cdc.gov/vaccines/acip/meetings/downloads/slides-2020-12/slides-12-19/05-COVID-CLARK.pdf

quote:

Op zondag 20 december 2020 14:04 schreef Momo het volgende:
https://www.cdc.gov/vaccines/acip/meetings/downloads/slides-2020-12/slides-12-19/05-COVID-CLARK.pdf

[ afbeelding ]

Dat is toch een stukje hoger. Alhoewel ze hier weer niet melden hoe lang die mensen problemen hadden.

Als het iets vergelijkbaars is met allergisch voor wespen/bijen en daarna een prik met een Epi-Pen waarna ze na een dag geen klachten meer hebben noem ik het 'snel herstel'.

ourworldindata is ook het aantal vaccinaties gaan tracken:
https://ourworldindata.org/covid-vaccinations

@freako in hoeverre zou CRISPR technieken de productie hebben kunnen vergemakkelijken of efficienter kunnen maken?

quote:

Op zondag 20 december 2020 15:09 schreef George_of_the_Jungle het volgende:
ourworldindata is ook het aantal vaccinaties gaan tracken:
https://ourworldindata.org/covid-vaccinations

@:Freako in hoeverre zou CRISPR technieken de productie hebben kunnen vergemakkelijken of efficienter kunnen maken?

Eerlijk antwoord: geen idee. Toen ik afstudeerde bestond die hele techniek nog niet. . Áls het gebruikt is, is het in de tweede stap van het proces dat ik beschreven heb. Maar dat is speculeren, daar schiet mijn kennis te kort..

Ik denk overigens dat het lastigste van het hele productieproces veel later zit. De eerste paar stappen zijn redelijk standaard biotechnologische technieken. Dat hoeft ook maar 1 keer te lukken. Het op grote schaal produceren van zuiver DNA-template en mRNA en het plaatsen van het mRNA in een of ander medium, dat is where the magic happens.

Canada staat ook op de kaart

https://www.bloomberg.com(...)global-distribution/

In de VS gaan ze deze week ook met Moderna aan de slag. Met Pfizer hebben ze nu ruim 500K vaccinaties gedaan.

quote:

Op zondag 20 december 2020 14:11 schreef Resistor het volgende:

[..]

Dat is toch een stukje hoger. Alhoewel ze hier weer niet melden hoe lang die mensen problemen hadden.

Als het iets vergelijkbaars is met allergisch voor wespen/bijen en daarna een prik met een Epi-Pen waarna ze na een dag geen klachten meer hebben noem ik het 'snel herstel'.

Het kan ook zijn dat iemand flinke hoofdpijn heeft, te moe om te werken, of spierpijn. Je lichaam wordt in verdedigingsmodes gekatapult, en gaat keihard aan de slag, wat veel energie kost.
Ik heb waarschijnlijk het Oxford vaccin gehad, en heb in mijn hele leven heel veel vaccins gehad omdat ik jarenlang in de tropen heb gewerkt. Ik heb nooit last van bijwerkingen gehad, maar dit keer heb ik me wel een dagje ziek gemeld omdat ik vermoeid was en een nacht heel weinig geslapen had (rillingen, koortsig, spierpijn), dus over het algemeen een rotgevoel. Alsof ik een ironman had gedaan (en ik heb wel eens een ironman gedaan). Maar na een dag was dat wel ok, alleen nog vermoeid, wat wel een paar dagen heeft aangehouden.
Nu is het Oxford vaccin niet echt te vergelijken met het Pfizer vaccin, het Oxford vaccin had wat meer bijwerkingen over het algemeen.

https://nos.nl/collectie/(...)-ontwikkelingslanden

Dit vroeg ik mij ook af. Als je ziet welke hoeveelheden NL gekocht hebt verwacht je dat we een inwoneraantal hebben van Duitsland.

quote:

Op maandag 21 december 2020 12:13 schreef icecreamfarmer_NL het volgende:
https://nos.nl/collectie/(...)-ontwikkelingslanden

Dit vroeg ik mij ook af. Als je ziet welke hoeveelheden NL gekocht hebt verwacht je dat we een inwoneraantal hebben van Duitsland.

Omdat mogelijk niet alle vaccines zullen slagen. Sanofi is al teruggestuurd naar de tekentafel.

quote:

Op maandag 21 december 2020 12:13 schreef icecreamfarmer_NL het volgende:
https://nos.nl/collectie/(...)-ontwikkelingslanden

Dit vroeg ik mij ook af. Als je ziet welke hoeveelheden NL gekocht hebt verwacht je dat we een inwoneraantal hebben van Duitsland.

Serum Institute India, de grootste vaccinmaker ter wereld, heeft een licentie om 1 miljard doses van het Oxford vaccin te maken. Er werd verwacht dat de helft daarvan geclaimd zou worden door India, en de andere helft is voor ontwikkelingslanden.
https://www.nytimes.com/2020/08/01/world/asia/coronavirus-vaccine-india.html

Interessant stuk over Pfizer vaccin:

https://www.janbhommel.co(...)het-sars-cov-2-virus